Tekućinska kromatografija glavna je metoda za ispitivanje sadržaja svake komponente i nečistoća u sirovinama, intermedijerima, pripravcima i materijalima za pakiranje, ali mnoge tvari nemaju standardne metode na koje se mogu osloniti, pa je neizbježan razvoj novih metoda. U razvoju metoda tekuće faze, kromatografska kolona je srž tekućinske kromatografije, pa je odabir odgovarajuće kromatografske kolone ključan. U ovom će članku autor objasniti kako odabrati kolonu tekućinske kromatografije s tri aspekta: sveukupne ideje, razmatranja i opseg primjene.
A. Sveukupne ideje za odabir kolona tekućinske kromatografije
1. Ocijenite fizikalna i kemijska svojstva analita: kao što su kemijska struktura, topljivost, stabilnost (kao što je lako se oksidira/reducira/hidrolizira), kiselost i lužnatost, itd., posebno je kemijska struktura ključna faktor u određivanju svojstava, kao što je konjugirana skupina koja ima jaku ultraljubičastu apsorpciju i jaku fluorescenciju;
2. Odredite svrhu analize: je li potrebna visoka separacija, visoka učinkovitost stupca, kratko vrijeme analize, visoka osjetljivost, otpornost na visoki tlak, dugi vijek trajanja stupca, niska cijena itd.;
- Odaberite odgovarajuću kromatografsku kolonu: razumite sastav, fizikalna i kemijska svojstva kromatografskog punila, kao što su veličina čestica, veličina pora, temperaturna tolerancija, pH tolerancija, adsorpcija analita itd.
- Razmatranja za odabir kolona tekućinske kromatografije
U ovom poglavlju raspravljat će se o čimbenicima koje treba uzeti u obzir pri odabiru kromatografske kolone iz perspektive fizičkih i kemijskih svojstava same kromatografske kolone. 2.1 Matrica punila
2.1.1 Matrica silika gela Matrica punila većine kolona tekućinske kromatografije je silika gel. Ova vrsta punila ima visoku čistoću, nisku cijenu, visoku mehaničku čvrstoću i lako je modificirati skupine (kao što su fenilne veze, amino veze, cijano veze itd.), ali pH vrijednost i temperaturni raspon koje podnosi su ograničeni: pH raspon većine silika gel matričnih punila je 2 do 8, ali pH raspon posebno modificiranih silika gel vezanih faza može biti čak 1,5 do 10, a postoje i posebno modificirane silika gel vezane faze koje su stabilne pri niskom pH, kao što je Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, koji je stabilan na pH 1 do 8; gornja granica temperature matrice silikagela obično je 60 ℃, a neke kromatografske kolone mogu tolerirati temperaturu od 40 ℃ pri visokom pH.
2.1.2 Polimerna matrica Polimerna punila su uglavnom polistiren-divinilbenzen ili polimetakrilat. Prednosti su im što podnose širok pH raspon – mogu se koristiti u rasponu od 1 do 14, a otporniji su na visoke temperature (mogu doseći i iznad 80 °C). U usporedbi s C18 punilima na bazi silicijevog dioksida, ova vrsta punila ima jaču hidrofobnost, a makroporozni polimer je vrlo učinkovit u odvajanju uzoraka kao što su proteini. Njegovi nedostaci su niža učinkovitost kolone i slabija mehanička čvrstoća nego kod punila na bazi silicija. 2.2 Oblik čestice
Većina modernih HPLC punila su sferne čestice, ali ponekad su nepravilne čestice. Sferne čestice mogu osigurati niži tlak u stupcu, veću učinkovitost stupca, stabilnost i dulji vijek trajanja; kada se koriste mobilne faze visoke viskoznosti (kao što je fosforna kiselina) ili kada je otopina uzorka viskozna, nepravilne čestice imaju veću specifičnu površinu, što pogoduje punom djelovanju dviju faza, a cijena je relativno niska. 2.3 Veličina čestica
Što je manja veličina čestica, to je veća učinkovitost kolone i veće odvajanje, ali je lošija otpornost na visoki tlak. Najčešće korištena kolona je kolona veličine čestica od 5 μm; ako je zahtjev za odvajanje visok, može se odabrati punilo od 1,5-3 μm, što je pogodno za rješavanje problema odvajanja nekih složenih matrica i višekomponentnih uzoraka. UPLC može koristiti punila od 1,5 μm; Za polupreparativne ili preparativne kolone često se koriste punila veličine čestica od 10 μm ili veće. 2.4 Sadržaj ugljika
Sadržaj ugljika odnosi se na udio vezane faze na površini silika gela, koji je povezan sa specifičnom površinom i pokrivenošću vezane faze. Visok sadržaj ugljika osigurava veliki kapacitet kolone i visoku rezoluciju, a često se koristi za složene uzorke koji zahtijevaju visoko razdvajanje, ali zbog dugog vremena interakcije između dviju faza, vrijeme analize je dugo; kromatografske kolone s niskim sadržajem ugljika imaju kraće vrijeme analize i mogu pokazati različite selektivnosti, a često se koriste za jednostavne uzorke koji zahtijevaju brzu analizu i uzorke koji zahtijevaju visoke uvjete vodene faze. Općenito, sadržaj ugljika u C18 kreće se od 7% do 19%. 2.5 Veličina pora i specifična površina
HPLC adsorpcijski mediji su porozne čestice, a većina interakcija odvija se u porama. Stoga molekule moraju ući u pore da bi se adsorbirale i odvojile.
Veličina pora i specifična površina dva su komplementarna pojma. Mala veličina pora znači veliku specifičnu površinu, i obrnuto. Velika specifična površina može povećati interakciju između molekula uzorka i vezanih faza, poboljšati zadržavanje, povećati punjenje uzorka i kapacitet stupca te odvajanje složenih komponenti. U ovu vrstu punila spadaju potpuno porozna punila. Za one koji imaju visoke zahtjeve za odvajanjem, preporučuje se odabir punila s velikom specifičnom površinom; mala specifična površina može smanjiti protutlak, poboljšati učinkovitost stupca i smanjiti vrijeme ravnoteže, što je prikladno za analizu gradijenta. U ovu vrstu punila spadaju punila jezgra-ljuska. Pod pretpostavkom da se osigura odvajanje, preporučuje se odabir punila s malom specifičnom površinom za one koji imaju visoke zahtjeve za učinkovitost analize. 2.6 Volumen pora i mehanička čvrstoća
Volumen pora, također poznat kao "volumen pora", odnosi se na veličinu praznine po jedinici čestice. Može dobro odražavati mehaničku čvrstoću punila. Mehanička čvrstoća punila s velikim volumenom pora nešto je slabija od punila s malim volumenom pora. Punila s volumenom pora manjim ili jednakim 1,5 mL/g uglavnom se koriste za HPLC separaciju, dok se punila s volumenom pora većim od 1,5 mL/g uglavnom koriste za molekularnu ekskluzionu kromatografiju i niskotlačnu kromatografiju. 2.7 Stopa zatvaranja
Zatvaranje može smanjiti vršne vršne efekte uzrokovane interakcijom između spojeva i izloženih silanolnih skupina (kao što su ionske veze između alkalnih spojeva i silanolnih skupina, van der Waalsove sile i vodikove veze između kiselih spojeva i silanolnih skupina), čime se poboljšava učinkovitost kolone i oblik vršne vrijednosti . Nezatvorene vezane faze proizvest će različite selektivnosti u odnosu na zatvorene vezane faze, posebno za polarne uzorke.
- Opseg primjene različitih kolona tekućinske kromatografije
Ovo poglavlje će opisati opseg primjene različitih tipova kolona tekućinske kromatografije kroz neke slučajeve.
3.1 C18 kromatografska kolona reverzne faze
Kolona C18 je najčešće korištena kolona reverzne faze, koja može zadovoljiti testove sadržaja i nečistoće većine organskih tvari, a primjenjiva je na srednje polarne, slabo polarne i nepolarne tvari. Tip i specifikacija kromatografske kolone C18 trebaju se odabrati prema posebnim zahtjevima za odvajanje. Na primjer, za tvari s visokim zahtjevima za razdvajanje često se koriste specifikacije od 5 μm*4,6 mm*250 mm; za tvari sa složenim matricama za odvajanje i sličnim polaritetom mogu se koristiti specifikacije od 4 μm*4,6 mm*250 mm ili manje veličine čestica. Na primjer, autor je upotrijebio kolonu od 3 μm*4,6 mm*250 mm za otkrivanje dviju genotoksičnih nečistoća u API-ju celekoksiba. Razdvajanje dviju tvari može doseći 2,9, što je izvrsno. Osim toga, pod premisom osiguravanja odvajanja, ako je potrebna brza analiza, često se odabire kratka kolona od 10 mm ili 15 mm. Na primjer, kada je autor koristio LC-MS/MS za otkrivanje genotoksične nečistoće u piperakin fosfatnom API-ju, korištena je kolona od 3 μm*2,1 mm*100 mm. Odvajanje između nečistoće i glavne komponente bilo je 2,0, a detekcija uzorka može se završiti za 5 minuta. 3.2 Fenilna kolona reverzne faze
Fenilna kolona također je vrsta kolone reverzne faze. Ova vrsta kolone ima jaku selektivnost za aromatske spojeve. Ako je odziv aromatskih spojeva mjeren običnom C18 kolonom slab, možete razmotriti zamjenu fenilne kolone. Na primjer, kad sam radio celecoxib API, odgovor glavne komponente mjeren fenilnom kolonom istog proizvođača i iste specifikacije (svi 5 μm*4,6 mm*250 mm) bio je oko 7 puta veći od C18 kolone. 3.3 Kolona normalne faze
Kao učinkovit dodatak koloni reverzne faze, kolona normalne faze prikladna je za visoko polarne spojeve. Ako je vršna vrijednost i dalje vrlo brza pri eluiranju s više od 90% vodene faze u stupcu reverzne faze, pa čak i blizu vrha otapala i preklapa se s njim, možete razmotriti zamjenu stupca normalne faze. Ovaj tip kolone uključuje hiličnu kolonu, amino kolonu, cijano kolonu itd.
3.3.1 Hilni stupac Hilični stupac obično ugrađuje hidrofilne skupine u vezani alkilni lanac kako bi se poboljšao odgovor na polarne tvari. Ova vrsta kolone je pogodna za analizu šećernih supstanci. Autor je ovu vrstu stupca koristio kada je radio sadržaj i srodne tvari ksiloze i njezinih derivata. Izomeri derivata ksiloze također se mogu dobro razdvojiti;
3.3.2 Amino kolona i cijano kolona Amino kolona i cijano kolona odnose se na uvođenje amino i cijano modifikacija na kraju vezanog alkilnog lanca, redom, kako bi se poboljšala selektivnost za posebne tvari: na primjer, amino kolona je dobar izbor za odvajanje šećera, aminokiselina, baza i amida; cijano kolona ima bolju selektivnost pri odvajanju hidrogeniranih i nehidrogeniranih strukturno sličnih tvari zbog prisutnosti konjugiranih veza. Amino kolona i cijano kolona često se mogu prebacivati između kolone normalne faze i kolone reverzne faze, ali se često prebacivanje ne preporučuje. 3.4 Kiralni stupac
Kiralna kolona, kao što ime sugerira, pogodna je za odvajanje i analizu kiralnih spojeva, posebno u području farmacije. Ovaj tip kolone može se uzeti u obzir kada konvencionalne kolone reverzne faze i normalne faze ne mogu postići odvajanje izomera. Na primjer, autor je koristio kiralnu kolonu od 5 μm*4,6 mm*250 mm za odvajanje dvaju izomera 1,2-difeniletilendiamina: (1S, 2S)-1,2-difeniletilendiamina i (1R, 2R)-1,2 -difeniletilendiamin, a razdvajanje između njih je dostiglo oko 2,0. Međutim, kiralne kolone su skuplje od drugih vrsta kolona, obično 1W+/kom. Ako postoji potreba za takvim stupcima, jedinica mora napraviti dovoljan proračun. 3.5 Kolona za ionsku izmjenu
Kolone za ionsku izmjenu prikladne su za odvajanje i analizu nabijenih iona, kao što su ioni, proteini, nukleinske kiseline i neke šećerne tvari. Prema vrsti punila dijele se na kationske izmjenjivačke kolone, anionske izmjenjivačke kolone i jake kationske izmjenjivačke kolone.
Kolone za kationsku izmjenu uključuju kolone na bazi kalcija i vodika, koje su uglavnom prikladne za analizu kationskih tvari kao što su aminokiseline. Na primjer, autor je koristio kolone na bazi kalcija pri analizi kalcijevog glukonata i kalcijevog acetata u otopini za ispiranje. Obje tvari imale su snažne odgovore na λ=210n, a stupanj razdvajanja dosegao je 3,0; autor je pri analizi tvari povezanih s glukozom koristio kolone na bazi vodika. Nekoliko glavnih povezanih tvari – maltoza, maltotrioza i fruktoza – imale su visoku osjetljivost pod diferencijalnim detektorima, s granicom detekcije od samo 0,5 ppm i stupnjem razdvajanja od 2,0-2,5.
Kolone za anionsku izmjenu uglavnom su prikladne za analizu anionskih tvari kao što su organske kiseline i halogeni ioni; jake kolone za kationsku izmjenu imaju veći kapacitet i selektivnost ionske izmjene i pogodne su za odvajanje i analizu složenih uzoraka.
Gore navedeno samo je uvod u vrste i područja primjene nekoliko uobičajenih kolona tekućinske kromatografije u kombinaciji s autorovim vlastitim iskustvom. Postoje i druge posebne vrste kromatografskih kolona u stvarnim primjenama, kao što su kromatografske kolone s velikim porama, kromatografske kolone s malim porama, kolone za afinitetnu kromatografiju, multimodne kromatografske kolone, kolone za tekućinsku kromatografiju ultra visoke učinkovitosti (UHPLC), kolone za superkritičnu tekućinsku kromatografiju ( SFC), itd. Imaju važnu ulogu u različitim područjima. Specifični tip kromatografske kolone treba odabrati prema strukturi i svojstvima uzorka, zahtjevima za odvajanje i drugim svrhama.
Vrijeme objave: 14. lipnja 2024