Principi i metode kvantitativne analize tekućinskom kromatografijom

Mehanizam odvajanja tekućinske kromatografije temelji se na razlici u afinitetu komponenata u smjesi za dvije faze.

Prema različitim stacionarnim fazama, tekućinska kromatografija se dijeli na tekućinsko-krutu kromatografiju, tekućinsko-tekućinsku kromatografiju i kromatografiju vezane faze.Najviše se koriste kromatografija tekućina-krutina sa silikagelom kao punilom i kromatografija vezane faze s mikrosilikagelom kao matricom.

Prema obliku stacionarne faze tekućinska kromatografija se može podijeliti na kromatografiju na stupcu, kromatografiju na papiru i tankoslojnu kromatografiju.Prema adsorpcijskom kapacitetu, može se podijeliti na adsorpcijsku kromatografiju, razdjelnu kromatografiju, kromatografiju ionske izmjene i gel permeacijsku kromatografiju.

Posljednjih godina visokotlačni sustav protoka tekućine dodan je sustavu kromatografije na tekućem stupcu kako bi mobilna faza brzo tekla pod visokim tlakom kako bi se poboljšao učinak odvajanja, tako da visokoučinkovita (poznata i kao visokotlačna) tekućinska kromatografija se pojavio.

DIO
01 Princip kvantitativne analize tekućinske kromatografije

Za kvantificiranje na temelju kvalitativnog, čiste tvari su potrebne kao standardi;

Kvantifikacija tekućinskom kromatografijom relativno je kvantitativna metoda: to jest, količina analita u smjesi procjenjuje se iz poznate količine čistog standardnog uzorka

DIO
02 Osnova za kvantifikaciju tekućinskom kromatografijom

Količina izmjerene komponente (W) proporcionalna je vrijednosti odziva (A) (visina vrha ili površina vrha), W=f×A.

Kvantitativni faktor korekcije (f): To je konstanta proporcionalnosti kvantitativne formule za izračun, a njegovo fizičko značenje je količina izmjerene komponente predstavljene jediničnom vrijednošću odziva (vršna površina).

Kvantitativni faktor korekcije može se dobiti iz poznate količine standardnog uzorka i njegove vrijednosti odgovora.

Izmjerite vrijednost odgovora nepoznate komponente, a količina komponente može se dobiti pomoću kvantitativnog faktora korekcije.

DIO
03 Uobičajeni pojmovi u kvantitativnoj analizi

Uzorak (uzorak): otopina koja sadrži analit za kromatografsku analizu.Podijeljen na standardne i nepoznate uzorke.

Standard: Čisti proizvod s poznatom koncentracijom.Nepoznati uzorak (unknow): smjesa čija se koncentracija ispituje.

Težina uzorka: izvorno vaganje uzorka koji se ispituje.

Razrjeđivanje: faktor razrjeđenja nepoznatog uzorka.

Komponenta : kromatografski vrh koji se kvantitativno analizira, to jest analit čiji je sadržaj nepoznat.

Količina komponente (količina): sadržaj (ili koncentracija) tvari koja se ispituje.

Cjelovitost : Računalni proces mjerenja površine pika kromatografskog pika računalom.

Kalibracijska krivulja: Linearna krivulja sadržaja komponente u odnosu na vrijednost odgovora, utvrđena iz poznate količine standardne tvari, koja se koristi za određivanje nepoznatog sadržaja analita.

DIO
04 Kvantitativna analiza tekućinske kromatografije

1. Odaberite kromatografsku metodu prikladnu za kvantitativnu analizu:

l Potvrdite vršnu vrijednost detektirane komponente i postignite razlučivost (R) veću od 1,5

l Odredite konzistenciju (čistoću) kromatografskih vrhova testiranih komponenti

l Odrediti granicu detekcije i granicu kvantifikacije metode;osjetljivost i linearni raspon

2. Postavite kalibracijsku krivulju sa standardnim uzorcima različitih koncentracija

3. Provjerite točnost i preciznost kvantitativnih metoda

4. Upotrijebite odgovarajući softver za upravljanje kromatografijom za provedbu prikupljanja uzoraka, obrade podataka i izvješća o rezultatima

DIO
05 Identifikacija kvantitativnih vrhova (kvalitativno)

Kvalitativno identificirajte svaki kromatografski vrh koji treba kvantificirati

Najprije upotrijebite standardni uzorak za određivanje vremena zadržavanja (Rt) kromatografskog vrha koji treba kvantificirati.Usporedbom vremena zadržavanja pronađite komponentu koja odgovara svakom kromatografskom piku u nepoznatom uzorku.Kromatografska kvalitativna metoda je usporedba vremena zadržavanja sa standardnim uzorkom.Kriterij Nedovoljnodaljnja potvrda (kvalitativna)

1. Standardna metoda dodavanja

2. Istovremeno koristite druge metode: druge kromatografske metode (promijenite mehanizam, kao što su: korištenje različitih kromatografskih kolona), druge detektore (PDA: usporedba spektra, pretraživanje spektralne knjižnice; MS: analiza masenog spektra, pretraživanje spektralne knjižnice)

3. Ostali instrumenti i metode

DIO
06 Potvrda kvantitativne vršne konzistencije

Potvrdite konzistenciju kromatografskog vrha (čistoću)

Provjerite postoji li samo jedna izmjerena komponenta ispod svakog kromatografskog vrha

Provjerite ima li smetnji od tvari koje se eluiraju (nečistoće)

Metode za potvrdu kromatografske vršne konzistencije (čistoća)

Usporedba spektrograma s fotodiodnim matričnim (PDA) detektorima

Identifikacija najveće čistoće

2996 Teorija kuta čistoće

Kvantitativne metode koje se obično koriste u DIJELU 07

Metoda standardne krivulje, podijeljena na metodu vanjskog standarda i metodu internog standarda:

1. Metoda vanjskog standarda: najviše se koristi u tekućinskoj kromatografiji

Niz standardnih uzoraka poznatih koncentracija pripremljen je korištenjem čistih uzoraka spojeva koji će se testirati kao standardni uzorci.ubrizgava u kolonu do svoje vrijednosti odgovora (vršna površina).
Unutar određenog raspona postoji dobar linearni odnos između koncentracije standardnog uzorka i vrijednosti odgovora, naime W= f×A, te se izrađuje standardna krivulja.

Pod točno istim eksperimentalnim uvjetima, ubrizgajte nepoznati uzorak kako biste dobili vrijednost odziva komponente koja se mjeri.Prema poznatom koeficijentu f može se dobiti koncentracija komponente koja se mjeri.

Prednosti metode vanjskog standarda:jednostavan rad i izračun, to je često korištena kvantitativna metoda;nema potrebe da se svaka komponenta detektira i eluira;potreban je standardni uzorak;uvjeti mjerenja standardnog uzorka i nepoznatog uzorka trebaju biti dosljedni;volumen injekcije treba biti precizan.

Nedostaci metode vanjskog standarda:Eksperimentalni uvjeti moraju biti visoki, kao što je osjetljivost detektora, brzina protoka i sastav mobilne faze se ne može mijenjati;volumen svake injekcije treba imati dobru ponovljivost.

2. Metoda internog standarda: točno, ali problematično, najčešće se koristi u standardnim metodama

Poznata količina internog standarda dodaje se standardu kako bi se dobio mješoviti standard, te se priprema niz radnih standarda poznate koncentracije.Molarni omjer standarda prema internom standardu u miješanom standardu ostaje nepromijenjen.Ubrizgajte u kromatografsku kolonu i uzmite (vršnu površinu standardnog uzorka/vršnu površinu internog standardnog uzorka) kao vrijednost odgovora.Prema linearnom odnosu između vrijednosti odziva i koncentracije radnog standarda, naime W= f×A, izrađuje se standardna krivulja.

Poznata količina internog standarda dodaje se nepoznatom uzorku i ubrizgava u kolonu kako bi se dobila vrijednost odziva komponente koja se mjeri.Prema poznatom koeficijentu f može se dobiti koncentracija komponente koja se mjeri.

Karakteristike metode internog standarda:Tijekom rada, uzorak i interni standard se miješaju i ubrizgavaju u kromatografsku kolonu, tako da sve dok je omjer količine mjerene komponente i internog standarda u miješanoj otopini konstantan, promjena volumena uzorka neće utjecati na kvantitativne rezultate..Metoda unutarnjeg standarda neutralizira utjecaj volumena uzorka, pa čak i mobilne faze i detektora, tako da je točnija od metode vanjskog standarda.

DIO
08 Čimbenici koji utječu na rezultate kvantitativne analize

Loša točnost može biti uzrokovana:

Netočna integracija površine vrha, razgradnja uzorka ili nečistoće unesene tijekom pripreme uzorka, bočica s uzorkom nije zapečaćena, isparavanje uzorka ili otapala, pogrešna priprema uzorka, problemi s ubrizgavanjem uzorka, pogrešna priprema internog standarda

Mogući razlozi loše preciznosti:

Netočna integracija vrha, problemi s ubrizgavanjem ili injektorom, razgradnja uzorka ili nečistoće unesene tijekom pripreme uzorka, kromatografski problemi, slabiji odziv detektora