kromatografija, također poznata kao "kromatografska analiza", "kromatografija", je metoda razdvajanja i analize koja ima vrlo širok raspon primjena u analitičkoj kemiji, organskoj kemiji, biokemiji i drugim područjima.
Utemeljitelj kromatografije je ruski botaničar M. Tsvetter.Godine 1906. ruski botaničar Zvetter objavio je rezultate svog eksperimenta: kako bi odvojio biljne pigmente, izlio je ekstrakt petrolejskog etera koji je sadržavao biljne pigmente u staklenu cijev s prahom kalcijevog karbonata i isprao ga petrolejskim eterom od vrha prema dolje.Budući da različiti pigmenti imaju različite kapacitete adsorpcije na površini čestica kalcijevog karbonata, procesom ispiranja različiti pigmenti se kreću prema dolje različitim brzinama, tvoreći tako trake različitih boja.Komponente pigmenta su odvojene.On je ovu metodu razdvajanja nazvao kromatografija.
Shematski prikaz pokusa odvajanja pigmenta lišća biljke
Kontinuiranim razvojem metoda odvajanja, sve više bezbojnih tvari postaje predmetom odvajanja, kromatografija također postupno gubi značenje "boje", no naziv je i danas u uporabi.
Kromatografska klasifikacija
Bit kromatografije je proces u kojem se molekule koje treba odvojiti dijele i uravnotežuju između stacionarne i mobilne faze.Različite tvari različito su podijeljene između dviju faza, zbog čega se kreću različitim brzinama s mobilnom fazom.Kretanjem mobilne faze dolazi do međusobnog odvajanja različitih komponenti u smjesi na stacionarnoj fazi.Ovisno o mehanizmu, može se podijeliti u različite kategorije.
1, prema klasifikaciji dvofaznog fizičkog stanja
Mobilna faza: Plinska kromatografija, tekućinska kromatografija, superkritična fluidna kromatografija
Stacionarna faza: plin-krutina, plin-tekućina;Tekućina-krutina, tekućina-tekućina
2, prema obliku klasifikacije stacionarne faze
Kromatografija na koloni: kromatografija na punjenoj koloni, kromatografija na kapilarnoj koloni, kromatografija na mikro punjenoj koloni, preparativna kromatografija
Ravninska kromatografija: papirna kromatografija, tankoslojna kromatografija, polimerna membranska kromatografija
3, klasificiran prema mehanizmu odvajanja
Adsorpcijska kromatografija: Različite komponente se odvajaju prema njihovim adsorpcijskim i desorpcijskim kapacitetima na adsorbentima
Razdjelna kromatografija: različite komponente se odvajaju prema njihovoj topivosti u otapalu
Molekularna ekskluziona kromatografija: prema veličini molekulske veličine odvajanja u kromatografiji ionske izmjene: različite komponente afiniteta za odvajanje ionsko-izmjenjivačke smole
Afinitetna kromatografija: odvajanje korištenjem prisutnosti specifičnog afiniteta između bioloških makromolekula
Kapilarna elektroforeza: komponente su odvojene prema razlikama u pokretljivosti i/ili ponašanju raspodjele
Kiralna kromatografija koristi se za odvajanje i analizu kiralnih lijekova, koji se mogu podijeliti u tri kategorije: metoda kiralnog derivatizacije reagensa;Metoda aditiva kiralne mobilne faze;Metoda razlučivanja kiralne stacionarne faze
Osnovna terminologija za kromatografiju
Krivulje dobivene iscrtavanjem signala odgovora komponenata nakon detekcije kromatografskog odvajanja u odnosu na vrijeme nazivaju se kromatogrami.
Osnovna linija:Pod određenim kromatografskim uvjetima, krivulja signala koja se stvara kada samo mobilna faza prolazi kroz sustav detektora naziva se bazna linija, kao što je prikazano u liniji ot.Kada su eksperimentalni uvjeti bili stabilni, osnovna linija bila je linija paralelna s vodoravnom osi.Osnovna linija odražava buku instrumenta, uglavnom detektora, tijekom vremena.
Visina vrha:okomita udaljenost između kromatografske vršne točke i bazne linije, označena s h, kao što je prikazano crtom AB.
Širina regije:Širina regije kromatografskog vrha izravno je povezana s učinkovitošću odvajanja.Postoje tri metode za opisivanje širine kromatografskog vrha: standardna devijacija σ, širina vrha W i FWHM W1/2.
Standardna devijacija (σ):σ je polovica udaljenosti između dviju točaka infleksije na krivulji normalne distribucije, a vrijednost σ označava stupanj disperzije komponenata od stupca.Što je veća vrijednost σ, komponente efluenta su dispergiranije i učinak odvajanja je lošiji.Suprotno tome, komponente otpadne vode su koncentrirane i učinak odvajanja je dobar.
Širina vrha W:Točke sjecišta s obje strane kromatografskog vrha koriste se kao tangente, a sjecište na baznoj crti naziva se širina vrha ili širina bazne crte, koja se također može izraziti kao W, kao što je prikazano na slici IJ.Prema načelu normalne distribucije, može se dokazati da je odnos između širine vrha i standardne devijacije W=4σ.
W1/2:Širina vrha na polovici visine vrha naziva se FWHM, kao što je prikazano za udaljenost GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W oba su izvedena iz σ i koriste se za izračunavanje površina vrhova uz mjerenje učinka kolone.FWHM mjerenje je praktičnije i najčešće korišteno.
kratak sažetak
Iz kromatografske vršne krivulje odljeva mogu se postići sljedeći ciljevi:
a, Kvalitativna analiza je provedena na temelju vrijednosti zadržavanja kromatografskih vrhova
b, kvantitativna analiza na temelju površine ili vrha kromatografskog vrha
C. Učinkovitost odvajanja kolone procijenjena je prema vrijednosti zadržavanja i širini vrha kromatografskog vrha
Formula za izračun uključena u kromatografiju
1. Vrijednost zadržavanja
Vrijednost zadržavanja je parametar koji se koristi za opisivanje stupnja do kojeg je komponenta uzorka zadržana u stupcu i koristi se kao pokazatelj kromatografske karakterizacije.Metoda njegovog predstavljanja je sljedeća:
Vrijeme zadržavanja tR
Vrijeme smrtitM
Podesite vrijeme zadržavanja tR'=tR-tM
(Ukupno vrijeme provedeno u stacionarnoj fazi)
Volumen zadržavanja
VR=tR*F. (neovisno o brzini mobilne faze)
Mrtvi volumen
VM=tM*Fc
(Prostor koji ne zauzima stacionarna faza na putu protoka od injektora do detektora)
Podesite volumen zadržavanja VR'=t'R*Fc
2. Relativna vrijednost zadržavanja
Relativna vrijednost zadržavanja, također poznata kao faktor razdvajanja, omjer koeficijenta raspodjele ili faktor relativnog kapaciteta, omjer je prilagođenog vremena zadržavanja (volumena) ispitivane komponente i prilagođenog vremena zadržavanja (volumena) standarda pod određenim kromatografskim uvjetima.
Relativne vrijednosti zadržavanja korištene su kako bi se eliminirao utjecaj određenih radnih uvjeta, kao što su brzina protoka i gubitak fiksacije, na vrijednosti zadržavanja.Standard u relativnoj retencijskoj vrijednosti može biti komponenta u ispitivanom uzorku ili umjetno dodan spoj.
3. Indeks retencije
Indeks zadržavanja je indeks zadržavanja tvari i koja se ispituje u fiksiranoj otopini X. Kao referentne tvari odabiru se dva n-alana, od kojih jedan ima broj ugljika N, a drugi N+n.Njihovo prilagođeno vrijeme zadržavanja je t 'r (N) odnosno t 'r (N+n), tako da je prilagođeno vrijeme zadržavanja t 'r (i) tvari i koja se ispituje točno između njih, tj. t 'r (N).
Indeks zadržavanja može se izračunati na sljedeći način.
4. Faktor kapaciteta (k)
U ravnoteži, omjer mase komponente u stacionarnoj fazi (s) i pokretnoj fazi (m), koji se naziva faktor kapaciteta.Formula je sljedeća:
5、Koeficijent raspodjele (K) U ravnoteži, omjer koncentracije komponente u stacionarnoj fazi (s) i mobilnoj fazi (m), koji se naziva koeficijent raspodjele.Formula je sljedeća
Odnos između K i k:
Odražava vrstu stupca i njegova važna svojstva strukture čvora
kratak sažetak
Odnos između vrijednosti zadržavanja i faktora kapaciteta i koeficijenta raspodjele:
Kromatografsko odvajanje temelji se na razlici u sposobnosti adsorpcije ili otapanja svake komponente u fiksnom relativnom uzorku, što se može kvantitativno izraziti veličinom vrijednosti koeficijenta raspodjele K (ili faktora kapaciteta k).
Komponente s jakom sposobnošću adsorpcije ili otapanja imaju veliki koeficijent raspodjele (ili faktor kapaciteta) i dugo vrijeme zadržavanja.Nasuprot tome, komponente sa slabom adsorpcijom ili topljivošću imaju mali koeficijent raspodjele i kratko vrijeme zadržavanja.
Osnovna teorija kromatografije
1. Teorija pladnja
(1) Iznijeti -- termodinamička teorija
Počelo je s modelom ploče tornja koji su predložili Martin i Synge.
Kolona za frakcioniranje: u ladici za nekoliko puta ravnoteže plin-tekućina, prema vrelištu različitog odvajanja.
Stupac: komponente su uravnotežene višestrukim podjelama između dvije faze i odvojene prema različitim koeficijentima raspodjele.
(2) Hipoteza
(1) U stupcu ima mnogo ladica, a komponente mogu brzo postići ravnotežu raspodjele unutar intervala ladica (to jest, visine ladice).
(2) Mobilna faza ulazi u kolonu, ali ne kontinuirano već pulsirajuće, odnosno svaki prolaz je volumen kolone.
(3) Kada je uzorak dodan u svaku ploču stupca, difuzija uzorka duž osi stupca mogla se zanemariti.
(4) Koeficijent raspodjele jednak je na svim posudama, neovisno o količini sastojaka.Odnosno, koeficijent raspodjele je konstantan na svakom tabanu.
(3) Načelo
Shematski dijagram teorije ladica
Ako se komponenta jedinične mase, naime m=1 (na primjer, 1mg ili 1μg), doda u ladicu br. 0, a nakon ravnoteže distribucije, jer je k=1, odnosno ns=nm, nm=ns=0,5.
Kada volumen ploče (lΔV) plina nosača uđe u ploču 0 u obliku pulsiranja, plin nosilac koji sadrži nm komponentu u plinovitoj fazi gura se na ploču 1. U to vrijeme, komponenta ns u tekućoj fazi ploče 0 a nm komponenta u plinovitoj fazi ploče 1 će se preraspodijeliti između dvije faze.Prema tome, ukupna količina komponenti sadržana u ploči 0 je 0,5, u kojoj su svaka plinovita i tekuća faza 0,25, a ukupna količina sadržana u ploči 1 je također 0,5.Plinska i tekuća faza također su bile 0,25.
Ovaj se postupak ponavlja svaki put kada novi plin nositelj volumena ploče pulsira u kolonu (vidi tablicu u nastavku).
(4) Jednadžba kromatografske krivulje istjecanja
σ je standardna devijacija, je vrijeme zadržavanja, C je koncentracija u bilo kojem trenutku,
C, koncentracija injekcije, odnosno ukupna količina komponenata (vršna površina A).
(5) parametri učinkovitosti kolone
Pri konstantnom tR, što je manji W ili w 1/2 (to jest, što je uži vrh), što je veći broj teoretskih ploča n, to je manja visina teorijske ploče i veća je učinkovitost odvajanja kolone.Isto vrijedi i za učinkovitu teoriju tray neff.Stoga je teoretski broj ladica indeks za procjenu učinkovitosti stupova.
(5) Karakteristike i nedostaci
> Prednosti
Teorija pladnja je poluempirijska i objašnjava oblik krivulje istjecanja
Ilustrirani su procesi podjele i odvajanja komponenti
Predložen je indeks za ocjenu učinkovitosti stupca
> Ograničenja
Komponente ne mogu stvarno postići ravnotežu distribucije u dvije faze:
Ne može se zanemariti uzdužna difuzija komponenti u stupcu:
Nije razmatran utjecaj različitih kinetičkih čimbenika na proces prijenosa mase.
Odnos između učinka stupca i brzine protoka mobilne faze ne može se objasniti:
Nije jasno koji glavni čimbenici utječu na učinak stupca
Ovi problemi su na zadovoljavajući način riješeni u teoriji stopa.
2. Teorija stopa
Godine 1956. nizozemski učenjak VanDeemter et al.apsorbirao je koncept teorije plitice i kombinirao kinetičke faktore koji utječu na visinu ladice, iznio kinetičku teoriju kromatografskog procesa - teoriju brzine i izveo VanDeemterovu jednadžbu.Smatra kromatografski proces dinamičkim neravnotežnim procesom i proučava utjecaj kinetičkih čimbenika na širenje vrha (tj. učinak stupca).
Kasnije su Giddings i Snyder et al.predložio je jednadžbu brzine tekućinske kromatografije (odnosno Giddingsovu jednadžbu) temeljenu na VanDeemterovoj jednadžbi (kasnije nazvanu jednadžbom brzine plinske kromatografije) i prema razlici svojstava između tekućine i plina.
(1) Van Deemterova jednadžba
Gdje je: H: visina ploče
A: koeficijent člana vrtložne difuzije
B: koeficijent molekularne difuzije
C: koeficijent člana otpora prijenosu mase
(2) Giddingsova jednadžba
Kvantitativna i kvalitativna analiza
(1) Kvalitativna analiza
Kvalitativnom kromatografskom analizom određuju se spojevi predstavljeni svakim kromatografskim vrhom.Budući da različite tvari imaju određene retencijske vrijednosti pod određenim kromatografskim uvjetima, retencijska vrijednost može se koristiti kao kvalitativni indeks.Različite kromatografske kvalitativne metode trenutno se temelje na vrijednostima zadržavanja.
Međutim, različite tvari mogu imati slične ili identične retencijske vrijednosti pod istim kromatografskim uvjetima, odnosno retencijske vrijednosti nisu isključive.Stoga je teško karakterizirati potpuno nepoznat uzorak samo na temelju retencijskih vrijednosti.Ako se na temelju razumijevanja izvora, prirode i svrhe uzorka može donijeti preliminarna prosudba o sastavu uzorka, mogu se koristiti sljedeće metode za određivanje spoja predstavljenog kromatografskim vrhom.
1. Kvalitativna kontrola korištenjem čistih tvari
Pod određenim kromatografskim uvjetima, nepoznanica ima samo definirano vrijeme zadržavanja.Stoga se nepoznata tvar može kvalitativno identificirati usporedbom vremena zadržavanja poznate čiste tvari pod istim kromatografskim uvjetima s vremenom zadržavanja nepoznate tvari.Ako su ta dva ista, nepoznata tvar može biti poznata čista tvar;Inače, nepoznato nije čista tvar.
Metoda kontrole čiste tvari primjenjiva je samo na nepoznatu tvar čiji je sastav poznat, čiji je sastav relativno jednostavan i čija je čista tvar poznata.
2. Metoda relativne retencijske vrijednosti
Relativna vrijednost zadržavanja α odnosi se na prilagodbu između komponente i i referentnih materijala. Omjer vrijednosti zadržavanja:
Mijenja se samo promjenom temperature fiksativa i kolone i nema nikakve veze s drugim radnim uvjetima.
Pri određenoj stacionarnoj fazi i temperaturi kolone mjere se prilagođene vrijednosti zadržavanja komponente i i referentne tvari s, a zatim se izračunavaju prema gornjoj formuli.Dobivene vrijednosti relativne retencije mogu se kvalitativno usporediti s odgovarajućim vrijednostima u literaturi.
3, dodavanjem poznatih tvari za povećanje metode visine vrha
Kada postoji mnogo komponenata u nepoznatom uzorku, dobiveni kromatografski vrhovi su previše gusti da bi se lako identificirali gornjom metodom ili kada se nepoznati uzorak koristi samo za određenu analizu predmeta.
"Prvo se napravi kromatogram nepoznatog uzorka, a potom se dobije daljnji kromatogram dodavanjem poznate tvari nepoznatom uzorku."Komponente s povećanim vršnim visinama mogu biti poznate za takve tvari.
4. Zadržati kvalitativnu metodu indeksa
Indeks retencije predstavlja ponašanje retencije tvari na fiksativima i trenutno je najčešće korišten i međunarodno priznat kvalitativni indeks u GC.Ima prednosti dobre ponovljivosti, jedinstvenog standarda i malog temperaturnog koeficijenta.
Indeks zadržavanja povezan je samo sa svojstvima stacionarne faze i temperaturom stupca, ali ne i s drugim eksperimentalnim uvjetima.Njegova točnost i ponovljivost su izvrsne.Sve dok je temperatura kolone ista kao ona stacionarne faze, vrijednost iz literature može se primijeniti za identifikaciju i nije potrebno koristiti čisti materijal za usporedbu.
(2)Kvantitativna analiza
Osnova za kromatografsku kvantifikaciju:
Zadatak kvantitativne analize je pronaći sto komponenti u miješanom uzorku
Frakcijski sadržaj.Kromatografska kvantifikacija temeljila se na sljedećem: kada su radni uvjeti bili dosljedni, bila je
Masa (ili koncentracija) mjerene komponente određena je odzivnim signalom koji daje detektor
Proporcionalno je.Naime:
Osnova za kromatografsku kvantifikaciju:
Zadatak kvantitativne analize je pronaći sto komponenti u miješanom uzorku
Frakcijski sadržaj.Kromatografska kvantifikacija temeljila se na sljedećem: kada su radni uvjeti bili dosljedni, bila je
Masa (ili koncentracija) mjerene komponente određena je odzivnim signalom koji daje detektor
Proporcionalno je.Naime:
1. Metoda mjerenja površine vrha
Površina pika je osnovni kvantitativni podatak koji se daje kromatogramima, a točnost mjerenja površine pika izravno utječe na kvantitativne rezultate.Za kromatografske pikove s različitim oblicima pikova korištene su različite metode mjerenja.
Teško je pronaći točnu vrijednost zime u kvantitativnoj analizi:
S jedne strane zbog poteškoća u preciznom mjerenju apsolutnog volumena ubrizgavanja: s druge strane
Područje pika ovisi o kromatografskim uvjetima, a kromatografsku traku treba održavati kada se vrijednost mjeri
Nije moguće niti zgodno učiniti istu stvar.Pa čak i ako to uspijete ispraviti
Točna vrijednost, također zato što ne postoji jedinstveni standard i ne može se izravno primijeniti.
2. Kvantitativni faktor korekcije
Definicija faktora kvantitativne korekcije: količina komponenti koje ulaze u detektor (m)
Omjer njegove površine kromatografskog vrha (A) ili visine vrha () je konstanta proporcionalnosti (,
Konstanta proporcionalnosti naziva se apsolutni faktor korekcije za komponentu.
Teško je pronaći točnu vrijednost zime u kvantitativnoj analizi:
S jedne strane zbog poteškoća u preciznom mjerenju apsolutnog volumena ubrizgavanja: s druge strane
Područje pika ovisi o kromatografskim uvjetima, a kromatografsku traku treba održavati kada se vrijednost mjeri
Nije moguće niti zgodno učiniti istu stvar.Pa čak i ako to uspijete ispraviti
Točna vrijednost, također zato što ne postoji jedinstveni standard i ne može se izravno primijeniti.
To jest, relativni faktor korekcije 'komponente je komponenta i referentni materijal s
Omjer apsolutnih faktora korekcije.
Može se vidjeti da je relativni faktor korekcije kada je kvaliteta komponente u odnosu na standard.
Kada je tvar s jednaka, područje vrha referentnog materijala je područje vrha komponente
Višestruki.Ako neka komponenta ima masu m i površinu vrha A, tada je broj f'A
Vrijednosti su jednake površini vrha referentnog materijala s masom od.Drugim riječima,
Pomoću relativnog korekcijskog faktora mogu se razdvojiti područja vrhova svake komponente
Pretvoreno u površinu vrha referentnog materijala jednaku njegovoj masi, zatim u omjer
Standard je unificiran.Dakle, ovo je normalizirana metoda za određivanje postotka svake komponente
Osnova količine.
Metoda dobivanja relativnog faktora korekcije: vrijednosti faktora relativne korekcije samo su uspoređivane s bit
Mjerenje se odnosi na standard i tip detektora, ali na radnu traku
Nema veze.Stoga se vrijednosti mogu pronaći iz referenci u literaturi.Ako tekst
Ukoliko u ponudi ne možete pronaći željenu vrijednost, možete je odrediti i sami.Metoda određivanja
Metoda: Određena količina mjerene tvari deset odabranih referentnih materijala → pretvorena u određenu koncentraciju
Izmjerena su područja kromatografskih vrhova A i As dviju komponenti.
To je formula.
3. Metoda kvantitativnog izračuna
(1) Metoda normalizacije područja
Zbroj sadržaja svih frakcija bez vršnih vrijednosti izračunat je kao 100% za kvantifikaciju
Metoda se naziva normalizacija.Njegova formula za izračun je sljedeća:
Gdje je P,% postotni sadržaj ispitanih komponenti;A1, A2... A n je komponenta 1. Područje vrha od 1~n;f'1, f'2... f'n je faktor relativne korekcije za komponente 1 do n.
(2) metoda vanjskog standarda
Metoda kvantitativne usporedbe između signala odgovora komponente koja se ispituje u uzorku i čiste komponente koja se ispituje kao kontrola.
(3) Metoda internog standarda
Metoda tzv. internog standarda je metoda u kojoj se standardnoj otopini ispitivane tvari i otopini uzorka kao interni standard dodaje određena količina čiste tvari, te zatim analizira i određuje.
(3)metoda standardnog dodavanja
Standardna metoda dodavanja, također poznata kao interna metoda dodavanja, je dodavanje određene količine (△C)
Referenca ispitivane tvari dodana je otopini uzorka koja se ispituje, a test je dodan u analizu
Vršna vrijednost otopine uzorka nakon tvari bila je viša od one izvorne otopine uzorka
Povećanje površine (△A) korišteno je za izračunavanje koncentracije tvari u otopini uzorka
Sadržaj (Cx)
Gdje je Ax područje vrha tvari koja se mjeri u izvornom uzorku.
Vrijeme objave: 27. ožujka 2023